¿Qué es?

Dot Blot es el nombre que recibe la técnica de hibridación que usa membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido. Esta técnica permite la detección de secuencias de ácidos nucleicos, ya sea ADN o ARN.

¿En què consiste?

Se coloca una gota de la muestra que se va a analizar, ya sea un lisado celular, un ácido nucleico purificado... en las membranas de nitrocelulosa o nailon. La técnica se lleva a cabo incubando las membranas con los reactivos por inmersión en recipientes herméticamente cerrados. 

Ventajas y desventajas del Dot Blot

Ventajas:

-Su simpleza y rapidez.

-Permitir el estudio simultáneo de varias muestras (al aplicarlas en diferentes partes de la membrana).

-Poderse realizar con sondas marcadas con haptenos o radioactivamente.
-Es barato (en comparación a otras técnicas de hibridación).

Desventajas:
-Precisa de material e instalaciones especializadas (para el uso de materiales radioactivos).

Protocolo

El protocolo para la realización de Dot Blot puede variar dependiendo del tipo de muestra, el marcaje utilizado... En nuestro caso, seguimos los siguientes pasos:

1: Aplicación de la muestra al soporte
2: Prehibridación 
3: Hibridación
4: Lavado de poshibridación
5: Detección del híbrido
6: Rehibridación

(1/6) Aplicación de la muestra al soporte

Antes de iniciar la aplicación de las muestras, humedecemos la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersiones durante 10 minutos en un tampón adecuado o agua destilada. Sacamos el líquido humectante y retiramos el exceso utilizando dos hojas de papel de filtro. 

A continuación, colocamos en un sistema de vacío, lo que permite la adecuada fijación de la membrana a la muestra.

Este sistema de vacío consta de:

·Plantilla con pocillos (donde colocar las aplicaciones).

·Membrana humedecida de nitrocelulosa o nailon (colocada debajo de la plantilla)

·Junta selladora (que se encarga de evitar la contaminación entre muestras)

Este conjunto se sitúa sobre una cámara colectora conectada al vacío (que se encarga de quitar la humedad de la muestra). Esta aplicación es diferente para ARN y ADN.

Muestras de ADN

1. La muestra de ADN debe ser desnaturalizada antes de aplicarla a la membrana. Para ello la sumergimos en una disolución de hidróxido sódico (NaOH) y EDTA durante diez minutos a 100ºC. 

2. A continuación se neutralizan con un volumen igual de acetato de amonio (C₂H₇NO₂₎

3. Una vez realizada la neutralización, se coloca la muestra de ADN en los pocillos designados y se aplica el vacío. Esto causa que el ADN sea retenido en la membrana, a la vez que los reactivos son filtrados a la cámara colectora.

4. Cada muestra es lavada con hidróxido sódico (NaOH) o SSC, y filtrándola al vacío.

5. Para terminar, desmontamos el sistema de vacío, lavamos la membrana con SSC y la dejamos secar a 80ºC durante 30~120 minutos (en caso de tratarse una membrana de nailon, esta puede ser fijada definitivamente utilizando rayos de luz ultravioleta). 

La unión del ADN a al membrana se realiza mediante azúcar-fosfato (de forma que las bases nitrogenadas queden libres para poder hibridar con la sonda). 

Muestras de ARN

1. La muestra de ARN debe ser desnaturalizada para evitar la formación de horquillas intracatenarias. en este caso el tratamiento es mas suave si se utiliza hidróxido sódico (NaOH) y EDTA.

2. Se realiza un lavado con la misma solución de acetato de amonio (C₂H₇NO_2).

3. Para finalizar el proceso extraemos la membrana del sistema de vacío y se lava con SSC y SDS. Las membranas de nitrocelulosa se secan de forma similar que en el caso de ADN (a 80ºC). En el caso de las de nailon se secan con la estufa o se irradian con UV.

(2/6) Prehibridación

Procedemos a incubar la membrana con la muestra en una solución de prehibridación. Esto impide las uniones inespecíficas de la sonda a la membrana. De esta forma nos aseguramos que tan solo la secuencia diana se pueda unir a la diana.

La solución de prehibridación posee una composición similar a las soluciones de hibridación, pero carece de sonda. Es la siguiente:
-SSC.
-SDS.
-Solución denhardt.
-EDTA.
-ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 microgramo/ml (evita las uniones inespecíficas a la membrana).

Con esta misma solución incubamos la membrana que utilizaremos para la hibridación (la duración varia de unos minutos a unas horas).

(3/6) Hibridación

Calentamos a 95-100ºC durante 5 minutos las sondas de ADN bicentenario para desnaturalizarlo y enfriamos con hielo. A continuación, retiramos la solución de prehibridación y la sustituimos por un volumen igual de solución fresca. Es entonces cuando añadimos la sonda de ADN ya desnaturalizada. Para finalizar este paso, incubamos la membrana con esta solución durante 4-24 horas.