A este paso llegamos tras utilizar el marcaje radioactivo, por lo tanto podemos realizar nuevas hibridaciones. Para ello desnaturalizamos los híbridos formados y eliminamos la primera sonda utilizada. Es fundamental cerciorarse de que la membrana permanezca siempre húmeda y no se seque durante la auto-radiografía. Para despegar la primera sonda, sometemos la membrana a dos lavados de 20 minutos cada uno con una solución de baja fuerza iónica (SSC), detergentes (SDS) y con una temperatura de 95ºC.
Para comprobar que el proceso ha sido satisfactorio, exponemos la membrana a una placa radiográfica toda la noche. En caso de que el lavado halla sido efectivo, la membrana se observará limpia.
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