¿Qué es?

Dot Blot es el nombre que recibe la técnica de hibridación que usa membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido. Esta técnica permite la detección de secuencias de ácidos nucleicos, ya sea ADN o ARN.

¿En què consiste?

Se coloca una gota de la muestra que se va a analizar, ya sea un lisado celular, un ácido nucleico purificado... en las membranas de nitrocelulosa o nailon. La técnica se lleva a cabo incubando las membranas con los reactivos por inmersión en recipientes herméticamente cerrados. 

Ventajas y desventajas del Dot Blot

Ventajas:

-Su simpleza y rapidez.

-Permitir el estudio simultáneo de varias muestras (al aplicarlas en diferentes partes de la membrana).

-Poderse realizar con sondas marcadas con haptenos o radioactivamente.
-Es barato (en comparación a otras técnicas de hibridación).

Desventajas:
-Precisa de material e instalaciones especializadas (para el uso de materiales radioactivos).

Protocolo

El protocolo para la realización de Dot Blot puede variar dependiendo del tipo de muestra, el marcaje utilizado... En nuestro caso, seguimos los siguientes pasos:

1: Aplicación de la muestra al soporte
2: Prehibridación 
3: Hibridación
4: Lavado de poshibridación
5: Detección del híbrido
6: Rehibridación

(1/6) Aplicación de la muestra al soporte

Antes de iniciar la aplicación de las muestras, humedecemos la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersiones durante 10 minutos en un tampón adecuado o agua destilada. Sacamos el líquido humectante y retiramos el exceso utilizando dos hojas de papel de filtro. 

A continuación, colocamos en un sistema de vacío, lo que permite la adecuada fijación de la membrana a la muestra.

Este sistema de vacío consta de:

·Plantilla con pocillos (donde colocar las aplicaciones).

·Membrana humedecida de nitrocelulosa o nailon (colocada debajo de la plantilla)

·Junta selladora (que se encarga de evitar la contaminación entre muestras)

Este conjunto se sitúa sobre una cámara colectora conectada al vacío (que se encarga de quitar la humedad de la muestra). Esta aplicación es diferente para ARN y ADN.

Muestras de ADN

1. La muestra de ADN debe ser desnaturalizada antes de aplicarla a la membrana. Para ello la sumergimos en una disolución de hidróxido sódico (NaOH) y EDTA durante diez minutos a 100ºC. 

2. A continuación se neutralizan con un volumen igual de acetato de amonio (C₂H₇NO₂₎

3. Una vez realizada la neutralización, se coloca la muestra de ADN en los pocillos designados y se aplica el vacío. Esto causa que el ADN sea retenido en la membrana, a la vez que los reactivos son filtrados a la cámara colectora.

4. Cada muestra es lavada con hidróxido sódico (NaOH) o SSC, y filtrándola al vacío.

5. Para terminar, desmontamos el sistema de vacío, lavamos la membrana con SSC y la dejamos secar a 80ºC durante 30~120 minutos (en caso de tratarse una membrana de nailon, esta puede ser fijada definitivamente utilizando rayos de luz ultravioleta). 

La unión del ADN a al membrana se realiza mediante azúcar-fosfato (de forma que las bases nitrogenadas queden libres para poder hibridar con la sonda). 

Muestras de ARN

1. La muestra de ARN debe ser desnaturalizada para evitar la formación de horquillas intracatenarias. en este caso el tratamiento es mas suave si se utiliza hidróxido sódico (NaOH) y EDTA.

2. Se realiza un lavado con la misma solución de acetato de amonio (C₂H₇NO_2).

3. Para finalizar el proceso extraemos la membrana del sistema de vacío y se lava con SSC y SDS. Las membranas de nitrocelulosa se secan de forma similar que en el caso de ADN (a 80ºC). En el caso de las de nailon se secan con la estufa o se irradian con UV.

(2/6) Prehibridación

Procedemos a incubar la membrana con la muestra en una solución de prehibridación. Esto impide las uniones inespecíficas de la sonda a la membrana. De esta forma nos aseguramos que tan solo la secuencia diana se pueda unir a la diana.

La solución de prehibridación posee una composición similar a las soluciones de hibridación, pero carece de sonda. Es la siguiente:
-SSC.
-SDS.
-Solución denhardt.
-EDTA.
-ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 microgramo/ml (evita las uniones inespecíficas a la membrana).

Con esta misma solución incubamos la membrana que utilizaremos para la hibridación (la duración varia de unos minutos a unas horas).

(3/6) Hibridación

Calentamos a 95-100ºC durante 5 minutos las sondas de ADN bicentenario para desnaturalizarlo y enfriamos con hielo. A continuación, retiramos la solución de prehibridación y la sustituimos por un volumen igual de solución fresca. Es entonces cuando añadimos la sonda de ADN ya desnaturalizada. Para finalizar este paso, incubamos la membrana con esta solución durante 4-24 horas.

(4/6) Lavado de poshibridación

En esta fase colocamos la membrana en una cubeta y procedemos a realizar los lavados de poshibridación. La solución contiene:

-Baja concentración en sales.

-Poca formamida.

-pH poco alcalino (<7)

(5/6) Detección del híbrido

En esta fase realizamos la detección del híbrido, la cual depende del tipo de marcaje que lleve la sonda.

-Marcado radioactivo: Al finalizar el último lavado de poshibridación, dejamos secar la membrana y la revelamos mediante exposición autoradiográfica. Esta exposición la realizamos colocando una placa radiográfica encima y manteniendo el conjunto en oscuridad durante horas o días. 

En nuestro caso, realizamos un sexto paso en el protocolo, y por ello no dejamos secar la membrana. La envolvemos en un plástico para mantener la humedad y evitar el contacto directo con la placa fotográfica.

-Marcado con haptenos:  Al finalizar el último lavado de poshibridación, lo revelamos con un método de detección cromogénico (que se basa en una reacción inmunohistoquímica). Por ejemplo:

La dioxigenina se une a un anticuerpo primario que a la vez se une a un anticuerpo secundario que lleva una enzima que hace que se catalice una reacción inmunohistoquímica. Esta reacción hace que se deposite en el lugar de la hibridación un producto coloreado soluble.

Este método impide una rehibridación, por lo que no es utilizada a menudo.

Sin embargo, la técnica más importante y utilizada es la del marcado radioactivo.

(6/6) Rehibridación

A este paso llegamos tras utilizar el marcaje radioactivo, por lo tanto podemos realizar nuevas hibridaciones. Para ello desnaturalizamos los híbridos formados y eliminamos la primera sonda utilizada. Es fundamental cerciorarse de que la membrana permanezca siempre húmeda y no se seque durante la auto-radiografía. Para despegar la primera sonda, sometemos la membrana a dos lavados de 20 minutos cada uno con una solución de baja fuerza iónica (SSC), detergentes (SDS) y con una temperatura de 95ºC. 

Para comprobar que el proceso ha sido satisfactorio, exponemos la membrana a una placa radiográfica toda la noche. En caso de que el lavado halla sido efectivo, la membrana se observará limpia.

Aplicaciones del Dot Blot

La técnica de hibridación conocida como Dot Blot tiene varias aplicaciones a la biología molecular. Lo más genérico es utilizarla como técnica de rastreo, pero hay otras aplicaciones específicas.

Dot Blot como técnica de rastreo

El Dot Blot se puede utilizar como técnica de rastreo para detectar varias secuencias de interés simultáneamente. Algunas de sus aplicaciones son:

-Estudios de expresión génica. En los cuales se detecta ARNm concretos en poblaciones celulares en situación basal y tras estimularlo, en células tumores...

-Detección de secuencias extrañas en muestras biológicas. Como bacterias, virus, parásitos...

-Control de calidad de PCR. en el que se puede comprobar la especificidad, así como aumentar la sensibilidad de la PCR (permitiendo la confirmación de casos dudosos). 

-Control de calidad del marcaje sondas. En el que se utiliza como muestra secuencias diana control. También permite calcular la sensibilidad el límite de detección de las sondas marcadas.

-La determinación del sexo en especies sin diferenciaciones fenotípicas. 

ASO Dot Blot

Se usa para detectar mutaciones, tanto en homocigosis como heterocigosis.  Requiere una PCR previa. 

Al producto que se obtiene de la PCR (la cual amplifica la región del gen que presenta las variaciones alélicas) se le hibrida con oligonucleótidos y se utiliza como muestra para el Dot Blot. 

Dot Blot inverso

Se asemeja a un ASO Dot blot pero al revés. 

Aquí, lo que se coloca en la membrana son los oligonucleótidos específicos de cada alelo (mutado y no mutado). Lo que se marca es el producto de la PCR, que es el gen que nos interesa (mediante el uso de cebadores marcados). Para cada caso se emplea una membrana que se híbrida con el producto marcado de la PCR. 

Hibridación de colonias

Se utiliza para detectar bacterias que contienen una secuencia génica concreta. A partir de una placa de cultivo, con colonias bacterianas aisladas, se recorta una membrana para el Dot Blot. A continuación, se lisan las bacterias y se desnaturaliza el ADN, colocando la membrana sobre un papel para que se seque. Se aplica calor y se produce a realizar un Dot Blot tradicional. 

Hibridación de placas virales

Tipo de dot Blot utilizado principalmente para detectar virus que portan la secuencia diana. Es especialmente relevante en tecnologia de ADN recombinante para localizar los fagos con la secuencia clonada.